MTT结果不准确？IC50不会算？让科研老腊肉来拯救你
作者：腊肉（转载请注：解螺旋·医生科研助手）
细胞增殖检测已经广泛应用于分子生物学、肿瘤生物学、免疫学和大规模药物筛选等研究领域。检测方法主要分为两类：一类是直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞增殖能力，如Ki67、BrdU以及EdU细胞增殖检测等；一类是通过测定活性细胞数目来间接反映细胞增殖能力，如MTT、CCK-8等。
在上述检测方法中，MTT法风靡各大实验室，一度成为科研老腊肉和小鲜肉的一项必备的实验技能。虽然MTT法由来已久且流传甚广，但是对于初次接触MTT的科研小白来说，要想在短时间内将MTT法练就得“稳（重复性好）、准（准确性高）、狠（操作速度快）”也是一个不小的挑战。
任性娇柔的细胞以及操作细节的忽视很容易就把你拉进“大幺蛾子没有，小幺蛾子不断”的悲催循环中。诸如细胞铺板不均匀、铺好的细胞状态差、复孔之间的吸光度差异大，以及吸光度值忽高忽低等各类小幺蛾子在MTT实验中屡见不鲜。
那么科研小鲜肉如何快速从老腊肉手里练就“稳、准、狠”的MTT技能呢？让小编慢慢告诉你。
1、MTT溶液配制
将MTT粉末用PBS配制成5 mg/mL的溶液，过滤除菌分装，避光储存于-20℃。临用前取出放置4℃。
2、细胞接种
将状态良好的细胞以合适的密度 接种于96孔板是MTT法的一个关键步骤。细胞的接种密度与细胞的种类以及给药孵育的时间密切相关，过多或过少的细胞密度都会影响实验结果的准确性和重复性。
因此在正式做MTT实验前不能依赖网上提供的MTT方法，需要通过预实验来确定细胞的接种密度。
1) 收集对数生长期的MCF-7细胞，用完全培养基将细胞浓度稀释成2000、3000、4000、5000、6000和8000 cells/mL的细胞悬液，以每孔100 μL细胞悬液接种于96孔板中，每个细胞浓度接种3孔即可，放入细胞培养箱内培养；
注意：接种细胞时先将细胞悬液吹打均匀，然后倒入加样槽内，用多通道移液器吸取细胞悬液后将枪头贴96孔板的孔壁添加细胞悬液，添加完成后不要晃动96孔板，直接放入细胞培养箱内培养。如此操作可以大大提高接种的均匀度，而且还可以使细胞在孔板内的均匀分布，不聚集。
2) 在接种后的第48、72和96 h取出96孔板，倒置显微镜下观察孔内细胞的生长汇合程度并拍照保存；
小编以96 h的观察结果为例（图1）。从图1中可以看出，以4000 cells/mL浓度接种的孔内细胞在培养96 h后生长汇合约80%~90%，而6000~8000 cells/mL浓度的孔内细胞已经长满，而细胞在长满状态下会发生接触抑制生长现象。
因此，后续若要采用MTT法考察药物作用于MCF-7细胞72 h后对细胞的毒性特性（或细胞增殖抑制），那么在接种MCF-7细胞时则宜按4000 cells/mL的细胞浓度接种于96孔板。这里选择观察96 h是将细胞接种后贴壁24 h与加药孵育72 h计算在了一起。
3) 确定好细胞接种浓度之后，按照上述方法以4000 cells/mL细胞浓度接种于96孔板中，并培养24 h使细胞贴壁。
注意：96孔板的外周孔共36孔不要接种细胞，用100 μL PBS填充。接种细胞时需要定时摇晃加样槽，防止加样槽内细胞悬液沉降，进而导致多通道移液器每次移取的细胞悬液数量不一致。
3、加药处理
1) 取出接种细胞的96孔板，吸弃孔内培养基，对照组加入200 μL完全培养基，加药组加入180 μL完全培养基，每组设置6个复孔为宜；
2) 将药物（或药物的DMSO溶液）用完全培养基稀释成10倍给药浓度的系列梯度浓度给药溶液；
3) 以每孔20 μL的量加入稀释的系列浓度梯度给药溶液，然后放入细胞培养箱内孵育72 h。
4、测定
1) 孵育结束后，取出96孔板，吸弃孔内药物溶液，用PBS清洗2次后加入20 μL MTT溶液，然后放入细胞培养箱内孵育4 h；
2) 孵育结束后，吸弃孔内MTT溶液，加入150 μL DMSO，轻微震荡10 min后用酶标仪在490 nm处测定吸光度值，并计算出平均值和SD（图2）。
注意：吸弃MTT溶液时适当倾斜96孔板，然后用多通道移液器贴壁吸取MTT溶液。
5、计算IC50值
1) 将浓度转换为对数形式并将给药组吸光度均值除以对照组吸光度均值得到细胞存活率均值（图3）；
2) 打开Graphpad Prism 7.00，选择XY图（图4）；
3) 将图3中的数据复制到Graphpad中，点击Analyze（图5），选择Nonliner regression (curve fit) （图6），点击OK；
4) 选择Dose-response-Inhibition项下的“[Inhibitor] vs. normalized response-Variable slope”（图7），点击OK；
5) 从图8中可以得到软件模拟计算出的药物IC50为1.28 ng/mL。选择图8中Graphs项下的Data 1可以得到数据图（图9），经过简单的调整就可以得到最终的数据图（图10）；
6、MTT法的更新版
虽然MTT法在细胞增殖检测方面应用广泛，但由于 MTT 法形成的甲臜不溶于水，需要先吸弃MTT溶液然后加入DMSO溶解之后才能测定，这不仅使测定的工作量增加，而且在吸弃MTT溶液时不可避免地会带走甲臜，因此也会降低实验结果的准确性和重复性。
因此检测试剂公司急科研小白之所急，瞄准商机开发了CCK-8试剂盒。与MTT法相比，CCK-8所产生的产物溶于水，因此在加入CCK-8孵育后立即可以进行吸光度检测，既提高了实验效率又增强了实验的重复性。
尽管有了MTT的更新版，但是前期实验设计包括细胞密度的确定以及药物浓度范围的筛选依然是该实验的关键。
如何用GraphPad Prism计算IC50值及绘制量效关系曲线
药物的量-效关系分析是药效评价中的基本分析之一，是以药效实验所得数据为基础而对药物作用进行科学评价的一种方法。药物的量-效关系反映了药效作用的剂量依赖性，因而可为药物使用剂量的确定提供依据。
半抑制浓度（或称半抑制率），即IC50 ，英文名称为half maximal inhibitory concentration。它能指示某一药物或者物质（抑制剂）在抑制某些生物程序（或者是包含在此程序中的某些物质，比如酶、细胞受体或是微生物）的半量。在凋亡方面，可以理解为一定浓度的某种药物诱导肿瘤细胞凋亡50%，该浓度称为50%抑制浓度，即凋亡细胞与全部细胞数之比等于50%时所对应的浓度，IC50 值可以用来衡量药物诱导凋亡的能力，即诱导能力越强，该数值越低，当然也可以反向说明某种细胞对药物的耐受程度。
本期内容利刃君就为大家分享使用Graphpad Prism绘制量-效关系曲线以及IC50值的计算 ，方法十分简单方便，相信大家很快就可以掌握。
操作步骤演示
在本例中我们以细胞生物学MTT实验数据为例为大家演示，MTT实验后得到的为吸光度值，这里我们已将数据进行处理，转换为细胞存活率。具体计算公式为：抑制率（%）=（药物实验组OD-药物对照孔平均OD）/（细胞对照孔平均OD-药物对照孔平均OD）x100%，这里就不再详细叙述了。处理完成的数据如下：
打开Graphpad Prism 软件，图表类型选择“XY ”，在Data table选项中勾选“Enter or import data into a new table ”；Options选项中勾选“Enter 6 replicate values in side-by-side subcolumns ”，在本例中，药物浓度有6个复孔，因此输入数字“6 ”，如果我们已经计算了SD值，那么可以选择“Enter and plot error values already calculated elsewhere ”选项。设置完成后，点击“Creat ”创建图表。
将Excel中的数据直接复制过来，如下图：
下面我们需要将浓度转换为对数形式，即转换X轴为log数值。在上方工具栏点击“Analyze ”，在新打开的Analyze Date对话框中，展开“Transform, Normalize ”项目列表，选择“Transform ”，点击“OK ”打开Parameters: Transform对话框。
勾选“Transform X values using ”选项，在右侧的下拉菜单中选择“X=Log（X） ”，点击“OK ”确认。
在界面左侧的导航栏“Results ”处，可以看到转换之后的数据，如下图：
同样的，在“Graphs ”处可以看到默认绘制的数据处理后的图形。
注： 在本例中我们发现有些数据点的误差线没有显示出来，这是因为误差线比数据点符号的大小短。我们只需修改数据点符号的大小即可。方法为：鼠标双击绘图区，打开Format Graph对话框，在“Show symbols ”选项中更改数据点的大小“Size ”即可。
接下来我们进行曲线拟合，在工具栏中点击“Analyze ”，在新打开的Analyze Date对话框中，展开“XY analyzes ”项目列表，选择“Nonlinear regression （cure fit） ”，点击“OK ”。
在新打开的Parameters: Nonlinear Regression对话框中，选择“Model ”选项卡，展开“Dose-Response-Inhibition ”列表，选择“[inhibitor] vs. Normalized response--Variable slope ”，点击“OK ”即可执行计算。
计算完成后，在左侧导航列表中“Results ”下的“Nonlin fit of Data 1 ”可看到计算结果。
在本例中，Best-fit values下，在横坐标Log（抑制剂浓度）在1.752时细胞的存活率刚好为50%，故该药物的半抑制浓度为IC50 = 56.43 μg/mL。
注： 在本例中，我们选择原始数据“Data 1 ”进行分析，即X轴未取对数。也可选择Log后的“Transform of Data 1 ”进行分析，此时就选择“log（inhibitor） vs. normalized response -- Variable slope ”。
分析的结果是一样的，IC50 = 56.43 μg/mL。在应用时，注意区分是Log前的还是Log后的，以防计算结果不准确。
此时，我们再次查看“Graphs ”下计算后的图形“Transform of Data 1 ”，如下图：
当然啦，默认获得的图形并不美观，可以根据自己的需要进行修饰美化，这些内容我们在前面的推文中已有介绍，这里就不再赘述。值得一提的是，我们可以将IC50 值通过文字工具添加到图形中。
本例中最终获得的图形如下：
以上就是利刃君为大家分享的使用Graphpad Prism 软件绘制量-效关系曲线以及计算IC50 值的全部内容啦，在之后的推文中，我们会继续为大家分享Graphpad Prism 进行科研绘图的教程，感兴趣的小伙伴可以关注一下哦~
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