MTT结果不准确？IC50不会算？让科研老腊肉来拯救你
作者：腊肉（转载请注：解螺旋·医生科研助手）
细胞增殖检测已经广泛应用于分子生物学、肿瘤生物学、免疫学和大规模药物筛选等研究领域。检测方法主要分为两类：一类是直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞增殖能力，如Ki67、BrdU以及EdU细胞增殖检测等；一类是通过测定活性细胞数目来间接反映细胞增殖能力，如MTT、CCK-8等。
在上述检测方法中，MTT法风靡各大实验室，一度成为科研老腊肉和小鲜肉的一项必备的实验技能。虽然MTT法由来已久且流传甚广，但是对于初次接触MTT的科研小白来说，要想在短时间内将MTT法练就得“稳（重复性好）、准（准确性高）、狠（操作速度快）”也是一个不小的挑战。
任性娇柔的细胞以及操作细节的忽视很容易就把你拉进“大幺蛾子没有，小幺蛾子不断”的悲催循环中。诸如细胞铺板不均匀、铺好的细胞状态差、复孔之间的吸光度差异大，以及吸光度值忽高忽低等各类小幺蛾子在MTT实验中屡见不鲜。
那么科研小鲜肉如何快速从老腊肉手里练就“稳、准、狠”的MTT技能呢？让小编慢慢告诉你。
1、MTT溶液配制
将MTT粉末用PBS配制成5 mg/mL的溶液，过滤除菌分装，避光储存于-20℃。临用前取出放置4℃。
2、细胞接种
将状态良好的细胞以合适的密度 接种于96孔板是MTT法的一个关键步骤。细胞的接种密度与细胞的种类以及给药孵育的时间密切相关，过多或过少的细胞密度都会影响实验结果的准确性和重复性。
因此在正式做MTT实验前不能依赖网上提供的MTT方法，需要通过预实验来确定细胞的接种密度。
1) 收集对数生长期的MCF-7细胞，用完全培养基将细胞浓度稀释成2000、3000、4000、5000、6000和8000 cells/mL的细胞悬液，以每孔100 μL细胞悬液接种于96孔板中，每个细胞浓度接种3孔即可，放入细胞培养箱内培养；
注意：接种细胞时先将细胞悬液吹打均匀，然后倒入加样槽内，用多通道移液器吸取细胞悬液后将枪头贴96孔板的孔壁添加细胞悬液，添加完成后不要晃动96孔板，直接放入细胞培养箱内培养。如此操作可以大大提高接种的均匀度，而且还可以使细胞在孔板内的均匀分布，不聚集。
2) 在接种后的第48、72和96 h取出96孔板，倒置显微镜下观察孔内细胞的生长汇合程度并拍照保存；
小编以96 h的观察结果为例（图1）。从图1中可以看出，以4000 cells/mL浓度接种的孔内细胞在培养96 h后生长汇合约80%~90%，而6000~8000 cells/mL浓度的孔内细胞已经长满，而细胞在长满状态下会发生接触抑制生长现象。
因此，后续若要采用MTT法考察药物作用于MCF-7细胞72 h后对细胞的毒性特性（或细胞增殖抑制），那么在接种MCF-7细胞时则宜按4000 cells/mL的细胞浓度接种于96孔板。这里选择观察96 h是将细胞接种后贴壁24 h与加药孵育72 h计算在了一起。
3) 确定好细胞接种浓度之后，按照上述方法以4000 cells/mL细胞浓度接种于96孔板中，并培养24 h使细胞贴壁。
注意：96孔板的外周孔共36孔不要接种细胞，用100 μL PBS填充。接种细胞时需要定时摇晃加样槽，防止加样槽内细胞悬液沉降，进而导致多通道移液器每次移取的细胞悬液数量不一致。
3、加药处理
1) 取出接种细胞的96孔板，吸弃孔内培养基，对照组加入200 μL完全培养基，加药组加入180 μL完全培养基，每组设置6个复孔为宜；
2) 将药物（或药物的DMSO溶液）用完全培养基稀释成10倍给药浓度的系列梯度浓度给药溶液；
3) 以每孔20 μL的量加入稀释的系列浓度梯度给药溶液，然后放入细胞培养箱内孵育72 h。
4、测定
1) 孵育结束后，取出96孔板，吸弃孔内药物溶液，用PBS清洗2次后加入20 μL MTT溶液，然后放入细胞培养箱内孵育4 h；
2) 孵育结束后，吸弃孔内MTT溶液，加入150 μL DMSO，轻微震荡10 min后用酶标仪在490 nm处测定吸光度值，并计算出平均值和SD（图2）。
注意：吸弃MTT溶液时适当倾斜96孔板，然后用多通道移液器贴壁吸取MTT溶液。
5、计算IC50值
1) 将浓度转换为对数形式并将给药组吸光度均值除以对照组吸光度均值得到细胞存活率均值（图3）；
2) 打开Graphpad Prism 7.00，选择XY图（图4）；
3) 将图3中的数据复制到Graphpad中，点击Analyze（图5），选择Nonliner regression (curve fit) （图6），点击OK；
4) 选择Dose-response-Inhibition项下的“[Inhibitor] vs. normalized response-Variable slope”（图7），点击OK；
5) 从图8中可以得到软件模拟计算出的药物IC50为1.28 ng/mL。选择图8中Graphs项下的Data 1可以得到数据图（图9），经过简单的调整就可以得到最终的数据图（图10）；
6、MTT法的更新版
虽然MTT法在细胞增殖检测方面应用广泛，但由于 MTT 法形成的甲臜不溶于水，需要先吸弃MTT溶液然后加入DMSO溶解之后才能测定，这不仅使测定的工作量增加，而且在吸弃MTT溶液时不可避免地会带走甲臜，因此也会降低实验结果的准确性和重复性。
因此检测试剂公司急科研小白之所急，瞄准商机开发了CCK-8试剂盒。与MTT法相比，CCK-8所产生的产物溶于水，因此在加入CCK-8孵育后立即可以进行吸光度检测，既提高了实验效率又增强了实验的重复性。
尽管有了MTT的更新版，但是前期实验设计包括细胞密度的确定以及药物浓度范围的筛选依然是该实验的关键。
「JMC」上海药物所首次发现海洋西松烷内酯在溃疡性结肠炎的应用
7月25日，中国科学院上海药物研究所天然药物研发中心郭跃伟/李序文团队联合代谢疾病研究中心李佳团队在Journal of Medicinal Chemistry 上发表了题为《The First Discovery of Marine Polyoxygenated Cembranolides as Potential Agents for the Treatment of Ulcerative Colitis》的研究成果，并被选为补充封面文章 。合作团队对海洋软珊瑚中典型西松烷二萜类分子进行了定向挖掘和系统构效关系分析，并对抗炎机制和体内抗溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis, UC）药效评价做了深入研究，充分展示了海洋天然产物—西松烷内酯可作为治疗溃疡性结肠炎药物的候选分子。
溃疡性结肠炎（UC）是一种肠道慢性非特异性炎症性疾病，临床表现为血便、腹泻和腹痛。UC在全球发病率日益上升，尤其是在亚洲和非洲等许多新兴工业化地区。尽管UC的病因仍不明确，但人们普遍认为该疾病的发生是外源物质引起宿主反应、基因和免疫三者相互作用的结果，病理机制涉及粘膜免疫系统稳态紊乱和肠上皮屏障受损。目前，可采用手术的方法或使用皮质类固醇、氨基水杨酸和抗生素等传统药物治疗UC，但这些药物存在严重的不良反应，且成本较高，只能在短期内缓解病情，无法实现疾病治愈和长期的预防。因此，迫切需要以全新的视角开发新型的UC治疗药物。
在该项研究中，研究人员首先利用基于HSQC的SMART导向技术，从中国南海软珊瑚Sinularia pedunculata中快速、精准定位具有特征结构的馏分，并从中分离出31个西松烷二萜，含6个新化合物，其中包括21个西松烷内酯。值得关注的是，sinupedunolide A (1) 具有罕见的在C-4和C-9位形成的过氧桥。有趣的是，sinupedunol A (2) 具有少见的七元醚环，而不具备α, β-不饱和内酯的结构片段。除了新颖化合物的发现，大样本量且结构多样的西松烷二萜的获得也为后续系统构效关系分析提供了坚实基础。
图1. 基于HSQC的SMART快速导向分离
巨噬细胞极化在炎症的进展中起着重要作用，通常由LPS诱导，特征是诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的高表达、NO的产生和促炎细胞因子的分泌。由于西松烷二萜有过抗炎活性的报道，为了进一步系统研究它们的潜在抗炎功效，研究人员测试了分离所得的31个西松烷二萜对LPS诱导的RAW264.7细胞中NO产生的抑制作用，结果表明具有α, β-不饱和内酯的西松烷二萜普遍具有显著的生物活性，其IC50值在亚微摩尔级别。构效分析表明，内酯片段是重要的活性来源，3,4位环氧的存在对活性有益。此外，C-11位的β取代显示出更好的活性，而在C-4至C-8的氧化对活性帮助不大，甚至可能导致活性的丧失。值得注意的是，化合物8和9表现出最优的抗炎活性，可显著抑制多种促炎细胞因子的转录和分泌。
图2. 西松烷二萜的构效关系分析
进一步机制研究发现化合物8和9显著抑制了NF-κB的转录活性，降低p65、ERK和JNK的磷酸化，抑制NF-κB和MAPK信号通路，从而减少炎症因子的产生。更为重要的是，在葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠急性溃疡性肠炎模型中，化合物8和9可以有效缓解结肠炎症，显著降低疾病活动指数（DAI）评分，及H&E组织病理学评分，同时抑制结肠中炎症细胞因子的表达，并改善肠道屏障的完整性。
总之，这项完全基于天然产物的化学多样性所开展的纯天然药物化学研究首次深入探索了海洋分子—西松烷内酯对UC的作用机制及其体内药效，为进一步开发西松烷内酯成为创新型UC药物提供了分子模板和骨架参考。
图3. 化合物8和9抑制NF-κB和MAPK信号通路
中国药科大学和上海药物所联合培养硕士研究生崔媛媛、南京中医药大学和上海药物所联合培养硕士研究生金洋（现中山大学和上海药物所联合培养博士研究生）和上海药物所硕士研究生孙若楠为本文共同第一作者，上海药物所李序文研究员、李佳研究员、郭跃伟研究员和孙一立副研究员为本文共同通讯作者。该工作得到上海市科学技术委员会等相关单位的资助。 特别感谢陈凯先院士的大力指导和帮助。
全文链接
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jmedchem.4c00950
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